Abstrak

Studi ini membandingkan dampak prapengobatan dengan melatonin dan N-asetilsistein (NAC) terhadap pencegahan kerusakan paru tikus setelah iskemia-reperfusi usus (iIR). Dua puluh delapan tikus Wistar jantan dewasa sehat (usia 12–16 minggu, berat 230–340 g) menjalani iskemia usus yang diinduksi oleh oklusi arteri mesenterika superior selama 60 menit, diikuti reperfusi selama 120 menit. Hewan dibagi menjadi empat kelompok (n=7 per kelompok): sham, hanya insisi abdomen; SS+iIR, prapengobatan dengan larutan garam dan iIR; NAC+iIR, prapengobatan dengan NAC (20 mg/kg) dan iIR; MEL+iIR, prapengobatan dengan melatonin (20 mg/kg) dan iIR. Stres oksidatif dan mediator inflamasi diukur, dan analisis histologis dilakukan pada jaringan paru. Data menunjukkan penurunan malondialdehid (MDA), mieloperoksidase (MPO), dan TNF-alfa pada hewan yang diprapengobatan dengan NAC atau MEL dibandingkan dengan yang diobati dengan SS+iIR (p<0,05). Peningkatan kadar superoksida dismutase (SOD) pada hewan yang diprapengobatan dengan NAC dan MEL dibandingkan dengan kelompok SS+iIR (34±8 U/g jaringan; p<0,05) juga diamati. Kadar TNF-alfa lebih rendah pada kelompok MEL+iIR (91±5 pg/mL) dibandingkan dengan kelompok NAC+iIR (101±6 pg/mL). Analisis histologis menunjukkan skor lesi paru yang lebih tinggi pada kelompok SS+iIR dibandingkan dengan kelompok yang diprapengobatan. Kedua agen secara individual memberikan efek perlindungan jaringan terhadap cedera paru yang diinduksi iIR, tetapi melatonin lebih efektif dalam memperbaiki parameter yang dianalisis dalam studi ini. Kata kunci: Melatonin; Iskemia-Reperfusi Usus; NAC; Sindrom Distres Pernapasan Akut; Model Eksperimental.

Pendahuluan

Iskemia-reperfusi usus (iIR) terjadi pada banyak situasi klinis, termasuk kolitis iskemik, iskemia mesenterika akut, syok septik, syok hemoragik atau traumatik, transplantasi usus kecil, luka bakar parah, dan kondisi lain yang berkontribusi terhadap kegagalan organ dengan angka kematian tinggi hingga 60%. Pada iIR, respons inflamasi dapat terjadi pada organ yang jauh dari titik cedera, yang mengakibatkan sindrom disfungsi organ multipel (MODS). MODS adalah proses berkelanjutan, bukan peristiwa tunggal, dengan derajat gangguan fisiologis yang meningkat secara bertahap pada organ individual. Fungsi organ dapat berubah dari disfungsi organ ringan hingga kegagalan organ yang sepenuhnya ireversibel. Paru-paru sangat rentan terhadap cedera tersebut, dan kondisi yang dihasilkan secara klinis didefinisikan sebagai sindrom distres pernapasan akut (ARDS) dan merupakan komponen utama MODS. Oleh karena itu, penting untuk mengembangkan terapi dan strategi untuk pencegahan dan pengobatan ARDS setelah iIR. N-asetilsistein (NAC) adalah antioksidan yang bekerja dengan membersihkan langsung spesies oksigen reaktif (ROS), seperti asam hipoklorit, hidrogen peroksida, superoksida, dan radikal hidroksil. Sementara itu, melatonin (MEL) atau N-asetil-5-metoksitriptamin disintesis dan disekresikan oleh kelenjar pineal, di antara organ lain. Melatonin memiliki efek antioksidan dan anti-inflamasi yang kuat dan bekerja dengan mengatur enzim antioksidan dan menurunkan regulasi enzim pro-oksidan. Melatonin adalah pemulung radikal bebas yang terkenal yang dapat menangkal efek berbahaya dari berbagai molekul. Melatonin memiliki efek perlindungan terhadap cedera paru yang diinduksi oleh iskemia-reperfusi. Selain itu, melatonin memiliki efek antioksidan pada cedera paru akut (ALI) yang disebabkan oleh sepsis, iskemia-reperfusi, dan situasi lain, dan mungkin pada infeksi sindrom pernapasan akut parah-coronavirus-2 (SARS-CoV-2). Secara keseluruhan, laporan yang diterbitkan menunjukkan bahwa NAC dan melatonin dapat mengganggu jalannya respons inflamasi dan memberikan efek penting pada homeostasis seluler. Namun, masih ada keraguan tentang peran agen ini dalam peradangan yang disebabkan oleh peristiwa iskemik usus. Dalam studi ini, kami menyelidiki apakah dosis tunggal melatonin atau NAC mengurangi cedera jaringan paru setelah IR arteri mesenterika superior pada tikus.

Bahan dan Metode

Semua prosedur eksperimental dilakukan mengikuti pedoman yang ditetapkan untuk perawatan etis hewan eksperimental dan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional (nomor persetujuan 6311 301018) dari Universitas Federal São Paulo (UNIFESP), di kota São Paulo, Brasil. Dua puluh delapan tikus Wistar jantan dewasa sehat (usia 12–16 minggu, berat 230–340 g) diperoleh dari Pusat Pengembangan Model Eksperimental untuk Biologi dan Kedokteran (CEDEME-UNIFESP). Hewan ditempatkan di lingkungan dengan suhu dan kelembaban terkontrol (22±1°C; kelembaban relatif, 50±5%), pada siklus gelap-terang 12/12 jam, dengan akses ke pakan pelet komersial dan air keran yang disaring secara ad libitum. Kami melakukan semua investigasi di Laboratorium Interdisipliner Investigasi Bedah di UNIFESP. Hewan secara acak dibagi menjadi empat kelompok eksperimental (n=7 per kelompok) sebagai berikut: kelompok sham, di mana hewan menerima injeksi intraperitoneal (i.p.) larutan garam 0,9% (2 mL) dan menjalani semua prosedur bedah, kecuali oklusi arteri mesenterika superior (tidak menjalani iIR); kelompok SS+iIR, sebelumnya diberikan (i.p.) larutan garam 0,9% (2 mL) dan menjalani iskemia selama 60 menit, diinduksi dengan penjepitan arteri mesenterika superior, diikuti reperfusi selama 120 menit; kelompok NAC+iIR, diprapengobatan dengan 20 mg/kg (1,22×10^-4 mol/kg) NAC (Fluimucil, Zambon Farmacêutica, SP, Brasil) dalam larutan garam 0,9% (i.p., dalam volume total 2 mL) diikuti oleh iIR, seperti yang dijelaskan di atas; kelompok MEL+iIR, diprapengobatan dengan 20 mg/kg (8,6×10^-5 mol/kg) melatonin dalam larutan garam 0,9% (i.p., dalam volume total 2 mL) diikuti oleh iIR, seperti yang dijelaskan di atas. Untuk perlakuan kelompok MEL+iIR, melatonin (Sigma-Aldrich, MO, USA) baru dilarutkan dalam etanol absolut. Larutan yang dihasilkan diencerkan dengan garam hingga konsentrasi 0,2% etanol dalam garam. Untuk kelompok SS+iIR dan NAC+iIR, volume etanol yang sama dengan yang digunakan untuk pelarutan melatonin ditambahkan ke dalam larutan garam dan NAC, masing-masing. Hewan dibius dengan xylazine hidroklorida (10 mg/kg; Syntec, SP, Brasil) dan ketamin hidroklorida (40 mg/kg; Syntec, SP, Brasil). Mereka ditempatkan di atas bantalan pemanas dalam posisi terlentang dan diimobilisasi menggunakan pita perekat. Setelah konfirmasi rencana anestesi dan persiapan bedah aseptik, 250 IU heparin (Liquemine, Roche, SP, Brasil) diberikan melalui vena femoralis kiri untuk mencegah pembekuan. Selanjutnya, vena femoralis digunakan untuk infus fentanil (2 mg/kg/jam). Kami melakukan laparotomi garis tengah, dan arteri mesenterika superior diidentifikasi, dibedah, dan dijepit, untuk semua hewan kecuali yang berada di kelompok sham. Hewan menerima dukungan ventilasi invasif (Model 683 Ventilator, Harvard Apparatus, MA, USA) dengan volume tidal (VT) 5 mL/kg, fraksi oksigen inspirasi (FiO2) 0,21, tekanan ekspirasi akhir positif 3 cmH2O, dan laju pernapasan (RR) 60-80 napas/menit. RR untuk setiap kelompok disesuaikan untuk mencapai normokapnia (tekanan karbon dioksida arteri, PaCO2, 35–45 mmHg). Relaksasi otot dipertahankan dengan 0,8 mg/kg (i.p.) pancuronium bromida (Pavulon-Organon, SP, Brasil). Suhu tubuh dipantau menggunakan termometer rektal. Situs bedah ditutup dengan jahitan polipropilen 2/0 untuk mencegah kehilangan panas, sementara hewan ditempatkan di atas bantalan pemanas. Setelah periode iskemia 60 menit, hewan dipertahankan dalam posisi terlentang dan dibius. Kemudian, penjepit dilepaskan dan reperfusi dilakukan selama 120 menit; dosis anestesi tambahan diberikan jika diperlukan. Untuk mencegah kekeringan kornea, salep mata lunak diberikan pada mata. Sampel darah arteri diperoleh dari karotis kanan setelah 120 menit reperfusi untuk mengevaluasi rasio tekanan oksigen arteri (PaO2)/fraksi oksigen inspirasi (FiO2). Pada akhir percobaan, hewan dieutanasia dengan Larutan Eutanasia T-61 (1 mL/100 g; Schering-Plough, SP, Brasil), dan nekropsi dilakukan. Paru-paru diinflasi hingga 25 cmH2O untuk pengukuran histologis kuantitatif dan diangkat secara en bloc. Paru kiri dibagi menjadi dua bagian: bagian atas direndam dalam larutan formalin 10%, dan bagian bawah disimpan pada -20°C untuk analisis biokimia selanjutnya. Bagian bawah jaringan paru kiri dihomogenisasi di atas es dalam 1 mL KCl 1,15% menggunakan sonikator (Q 700, QSonica, CT, USA) dan disentrifugasi (10.000 rpm pada 4°C selama 20 menit). Sampel supernatan disiapkan dan dialokasikan untuk pengukuran malondialdehid (MDA), mieloperoksidase (MPO), superoksida dismutase (SOD), dan faktor nekrosis tumor (TNF)-alfa. Tingkat aktivitas MPO dipelajari pada jaringan paru dan dinyatakan sebagai U/g protein. Aktivitas MPO dianalisis secara spektrofotometri, seperti yang dijelaskan sebelumnya. Tingkat MDA ditentukan oleh reaksi asam tiobarbiturat, seperti yang dijelaskan sebelumnya. Dalam tes reaksi asam tiobarbiturat, malondialdehid (atau zat mirip malondialdehid) bereaksi dengan asam tiobarbiturat untuk menghasilkan kromogen merah muda dengan puncak serapan pada 532 nm pada spektrofotometer. Tingkat jaringan dinyatakan sebagai nmol/g jaringan. Aktivitas SOD ditentukan menurut metode yang dijelaskan sebelumnya dan diuji sebagai inhibisi reduksi fotokimia nitroblue tetrazolium pada 560 nm. Aktivitas SOD dinyatakan sebagai U/g jaringan. Lobus tengah paru kanan dihomogenisasi dan disentrifugasi untuk mendapatkan supernatan. Kandungan TNF-alfa diukur sesuai dengan instruksi pabrik (Rat TNF-alpha, ELISA kit, RD System, MN, EUA). TNF-alfa dinyatakan sebagai pg/mL. Spesimen paru kiri diinflasi dan difiksasi dalam formalin buffered 10%, diproses menggunakan teknik standar, dan dibenamkan dalam parafin. Irisan penampang (5 µm tebal) diambil dari zona tengah paru dan dipasang pada slide. Slide diwarnai dengan hematoxylin dan eosin, kemudian diperiksa di bawah mikroskop cahaya yang digandeng dengan kamera video (Axiolab Standard 2.0, AxionCam; Zeiss, Jena, Jerman). Cedera paru dinilai pada skala 0 hingga 3 (0, tidak ada; 1, ringan; 2, sedang; 3, berat). Sepuluh bidang dipilih secara acak untuk evaluasi, dan tingkat keparahan cedera paru dinyatakan dengan total skor setiap hewan. Semua penilaian histopatologis dilakukan secara buta oleh ahli patologi yang tidak mengetahui kelompok perlakuan. Analisis statistik: Semua hasil disajikan sebagai rata-rata±standar deviasi (m±SD). Hasil analitik dievaluasi menggunakan Statistical Package for the Social Sciences, versi 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Analisis varians satu arah (ANOVA; untuk lebih dari dua variabel) digunakan untuk menentukan perbedaan antara kelompok, dan uji Tukey diterapkan untuk memverifikasi perbedaan statistik antara kelompok. Nilai dengan p<0,05 dianggap signifikan secara statistik, tidak termasuk analisis histologis.

Hasil

Semua tikus bertahan hingga akhir periode studi. Analisis gas darah menunjukkan penurunan indeks oksigen (PaO2/FiO2) pada kelompok SS+iIR dibandingkan dengan kelompok yang diprapengobatan dengan NAC dan melatonin (p<0,05). Selain itu, kelompok MEL+iIR menunjukkan respons yang lebih baik daripada kelompok NAC+iIR (p<0,05). Aktivitas MPO lebih tinggi pada kelompok SS+iIR (0,57±0,03 U/g protein) dibandingkan dengan kelompok NAC+iIR (0,32±0,05 U/g protein) dan MEL+iIR (0,25±0,04 U/g protein) (p<0,001). Kadar MDA lebih tinggi (p<0,001) pada kelompok SS+iIR (9,15±0,54 nmol/mg protein) dibandingkan dengan kelompok NAC+iIR (5,93±0,71 nmol/mg protein) dan MEL+iIR (5±0,48 nmol/mg protein). Kadar SOD lebih tinggi pada kelompok NAC+iIR (64±3,5 U/g jaringan) dan MEL+iIR (74,2±6 U/g jaringan) dibandingkan dengan kelompok SS+iIR (34±8 U/g jaringan; p<0,001). Kadar TNF-alfa lebih tinggi pada kelompok SS+iIR (128±4 pg/mL) dibandingkan dengan kelompok NAC+iIR (101±6 pg/mL) dan MEL+iIR (91±5 pg/mL; p<0,001). Selain itu, TNF-alfa lebih rendah pada kelompok MEL+iIR dibandingkan dengan kelompok NAC+iIR (p<0,01). Jaringan paru dianalisis di bawah mikroskop cahaya. Kelompok sham menunjukkan struktur jaringan paru normal. Sebaliknya, kerusakan parah pada area paru diamati pada kelompok SS+iIR. Namun, prapengobatan dengan melatonin dan NAC memperbaiki cedera paru yang diinduksi iIR, tetapi kelompok MEL+iIR menunjukkan perbaikan yang lebih besar dibandingkan dengan kelompok NAC+iIR. Pemeriksaan histopatologis menunjukkan penampilan normal parenkim paru pada kelompok sham. Selain itu, kelompok SS+iIR menunjukkan skor yang lebih tinggi (2,86±0,38; p<0,001) dibandingkan dengan kelompok NAC+iIR (2,28±0,49) dan MEL+iIR (1,85±0,37).

Diskusi

Dalam studi ini, kami menunjukkan bahwa prapengobatan dengan NAC atau melatonin dapat mencegah cedera paru yang diinduksi iIR pada tikus. Cedera yang diinduksi oleh iIR terkait dengan berbagai kondisi klinis, termasuk enterokolitis nekrotikans neonatal, volvulus usus tengah, abdomen akut obstruktif, hernia inkarserata, sepsis, dan syok hemoragik. Kerusakan paru terjadi setelah oklusi arteri sementara. Kerusakan iskemik dihasilkan dari penurunan aliran darah ke organ. Ketika mengembalikan aliran darah, kerusakan yang lebih parah terjadi, yang disebut cedera reperfusi. Cedera IR melibatkan peningkatan generasi radikal oksigen. Radikal bebas telah terbukti memainkan peran signifikan dalam etiologi cedera paru jarak jauh pada model hewan. Telah sering ditunjukkan bahwa cedera paru umumnya terjadi setelah iskemia otot rangka karena pelepasan radikal bebas dari jaringan yang direperfusi. Berbagai macam model hewan telah digunakan untuk mengidentifikasi mekanisme dan pengobatan potensial iIR, seperti penjepitan arteri mesenterika usus. Dalam studi ini, kami menerapkan model yang banyak digunakan dengan menjepit arteri mesenterika superior untuk mengeksplorasi efek prapengobatan melatonin dan NAC pada ALI yang diinduksi oleh iIR. Okutan et al., menggunakan tikus yang diprapengobatan dengan 20 mg/kg melatonin dan menjalani cedera paru oleh oklusi aorta infrarenal selama 30 menit dan reperfusi selama 12 jam, menunjukkan penurunan signifikan dalam aktivitas MPO dan kadar MDA. Data kami menunjukkan bahwa perlakuan melatonin mengurangi stres oksidatif, yang tercermin dalam penurunan kadar MPO dan MDA. MPO memainkan peran fundamental dalam produksi oksidan potensial oleh neutrofil. Neutrofil adalah sumber utama radikal bebas oksigen. Studi sebelumnya dengan jelas menunjukkan bahwa IR otot rangka menyebabkan peradangan paru jarak jauh, yang ditandai dengan peningkatan aktivitas MPO dan infiltrasi neutrofil yang signifikan ke dalam paru. Kadar oksida nitrat adalah penentu signifikan dari proses cedera paru yang disebabkan oleh iIR ekstremitas bawah. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa penjepitan arteri mesenterika superior selama 45 menit menyebabkan rekrutmen neutrofil. Beberapa studi telah mengkonfirmasi akumulasi PMN di jaringan vaskular lokal dan jarak jauh oleh iIR, dan akumulasi PMN telah ditunjukkan oleh peningkatan MPO dan MDA. Hasil studi ini menunjukkan bahwa prapengobatan melatonin atau NAC mengurangi kadar MDA dan MPO. Cedera paru setelah iIR dapat mengaktifkan PMN melalui proses yang memerlukan keterlibatan ROS. Studi kami memperkuat data ini karena pengurangan MPO dan MDA serta peningkatan kadar SOD diamati pada tikus yang diprapengobatan. Investigasi ini juga memperluas informasi dengan menunjukkan efek yang lebih baik pada kelompok yang diprapengobatan dengan melatonin, yang menunjukkan pengurangan MDA dan peningkatan kadar SOD, menunjukkan bahwa MEL dapat memberikan perlindungan terhadap cedera paru dalam model kami. Melatonin dan metabolitnya memiliki sifat antioksidan in vitro, baik dalam sel maupun cairan tubuh. Selain itu, melatonin memainkan peran penting dalam mengaktifkan pertahanan antioksidan dan melindungi sel dari beban oksidatif dan apoptosis yang diinduksi oleh kerusakan DNA mitokondria. Studi kami mengkonfirmasi penurunan respons oksidatif dengan peningkatan kadar SOD setelah prapengobatan melatonin. Sitokin proinflamasi berkurang pada tikus yang diprapengobatan dengan melatonin dan NAC dalam kondisi lain. Studi kami menunjukkan efek melatonin yang lebih baik daripada NAC dalam pengurangan TNF-alfa atau mediator proinflamasi. NAC memiliki efek samping toksik, seperti mual, muntah, diare, dan iritasi gastrointestinal. Namun, tidak ada efek samping melatonin pada dosis berapa pun yang telah dijelaskan. IR usus terjadi pada beberapa kondisi klinis dan sering menyebabkan kerusakan pada organ lain, termasuk paru, menyebabkan kegagalan multi-organ. Hasilnya sangat merugikan pasien dan bahkan dapat menyebabkan kematian. Studi ini menunjukkan bahwa usus memiliki efek inflamasi lokal sebelum dan setelah reperfusi. Produk yang dihasilkan secara lokal tidak tetap terisolasi. Dengan demikian, kami memahami usus sebagai 'mesin' peradangan dan karena memiliki akses ke kompartemen lain, ini memungkinkan mediator inflamasi untuk memperkuat respons sistemik. Studi kami memiliki beberapa keterbatasan. Pertama, kami tidak menyelidiki peran NAC dan melatonin dalam cedera paru yang diinduksi iIR melalui jalur inflamasi. Jalur inflamasi dan oksidatif yang tepat perlu dijelaskan di masa depan. Kedua, penelitian kami dilakukan menggunakan model hewan, dan dengan demikian, penelitian klinis lebih lanjut diperlukan. Ketiga, tes darah arteri hanya dilakukan pada akhir reperfusi, dan evaluasi selama periode waktu yang diperpanjang diperlukan. Selain itu, penanda biokimia serum lainnya belum dievaluasi.

Kesimpulan

Sebagai kesimpulan, studi kami menunjukkan bahwa prapengobatan dengan NAC atau melatonin memiliki potensi untuk melindungi terhadap cedera pada organ jarak jauh, seperti paru. Selain itu, prapengobatan dengan melatonin meningkatkan pertukaran gas, mengurangi sitokin inflamasi dan stres oksidatif, dan mengurangi keparahan cedera paru pada model tikus IR mesenterika kami.